La búsqueda del olfato

Linda Brown Buck, nacida el 29 de enero de 1947 en Seattle, es una bióloga estadounidense conocida por sus trabajos sobre el sistema olfativo. Junto con Richard Axel, fue galardonada con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2004, por sus trabajos sobre los receptores olfativos.

Buck nació en Seattle (Estados Unidos) el 29 de enero de 1947. Su padre era un ingeniero eléctrico que se dedicaba a inventar y construir aparatos en su tiempo libre, mientras que su madre era una ama de casa que pasaba la mayor parte de su tiempo libre resolviendo crucigramas. Buck era la segunda de tres hijos, todos ellos niñas. En 1994 Buck conoció a Roger Brent, también biólogo. Se casaron doce años después.

Buck decidió aprender biología molecular y se incorporó al laboratorio de Axel donde empezó a trabajar con Aplysia, un molusco enorme que tiene un grupo reducido de grandes neuronas con las que se puede trabajar una a una. Cuando se acercaba al final de ese proyecto, leyó un artículo que, en sus palabras, le cambió la vida. Se trataba de una publicación de 1985 del grupo de Sol Snyder que discutía los posibles mecanismos subyacentes a la detección de olores. Era la primera vez que pensaba en la olfacción y le fascinó. ¿Cómo podían los humanos y otros mamíferos detectar 10.000 o más sustancias químicas olorosas, y cómo podían sustancias químicas casi idénticas generar percepciones de olor diferentes? Era un rompecabezas monumental y un problema de una diversidad sin precedentes. Era obvio que el primer paso para resolver el rompecabezas era determinar cómo se detectan inicialmente los odorantes en la nariz. Esto significaba identificar los receptores de los aromas, una clase de moléculas cuya existencia se había propuesto, pero que no se había encontrado.

Aunque había diversas propuestas sobre qué tipo de moléculas podrían interactuar con los odorantes, había pruebas convincentes de que la transducción olfativa implicaba aumentos de AMPc inducidos por proteínas G, por lo que que fueran receptores acoplados a proteínas G (GPCR) parecía la mejor opción. El problema es que el conocimiento sobre los GPCR era escaso, y se sabía menos sobre los receptores olfativos, incluyendo su número y tamaño. Buck contaba: «Axel solía decir: “¿Cuántos receptores crees que hay? ¿20? ¿100?” Yo decía: “No lo sé, ¡me gustaría saberlo!”». Buck era el único postdoc que trabajaba en la olfacción de los mamíferos en el laboratorio de Axel en Columbia. Durante tres años, buscó los genes de los receptores olfativos. La tarea era complicada: tenía que encontrar una familia de genes desconocida de considerable tamaño y diversidad de secuencias de aminoácidos y, sin embargo, paradójicamente, esta familia debería tener una homología significativa con otras familias de GPCR. No era como buscar una aguja en un pajar, era algo peor, era como buscar una aguja concreta en un montón de otras agujas.

Buck persiguió múltiples estrategias: cribado de réplicas de ADN complementario olfativo (ADNc), sustracción de ADNc, clonación de genes relacionados… Todo sin éxito. Hasta que una herramienta revolucionaria entró en la biología: la PCR.

Cuando aparecieron los artículos sobre la PCR, me emocioné. Porque pensé que la PCR abriría la puerta a muchas cosas. Era como una droga milagrosa para los biólogos moleculares. No sólo en la búsqueda de receptores. Era una herramienta que obviamente permitiría a la gente hacer muchas cosas diferentes que antes no podían hacer. Espectacular. Piensa en lo que el primer microscopio permitió hacer a la gente; podían mirar, podían ver cosas. Para mí se trata de poder ver cosas.

Tras probar varios enfoques diferentes, Buck buscó la familia de receptores de odorantes diseñando experimentos basados en tres supuestos. En primer lugar, dado que los odorantes varían en su estructura y pueden ser discriminados, habría una familia de receptores olfativos variados, pero relacionados, que estarían codificados por una familia multigénica. En segundo lugar, los receptores de odorantes estarían al menos lejanamente relacionados con el conjunto relativamente pequeño de receptores acoplados a proteínas G cuyas secuencias se conocían en ese momento. Y, por último, los receptores de odorantes se expresarían selectivamente en el epitelio olfativo, donde se encuentran las neuronas sensoriales olfativas.

La PCR estaba diseñada para amplificar secuencias de ADN conocidas utilizando cebadores complementarios a la secuencia. ¿Qué distinguió el enfoque de Buck? ¿Qué hizo para convertir la PCR en un instrumento para descubrir secuencias desconocidas? Buck empezó como todo el mundo: probando el par de cebadores diseñado para complementar la secuencia de dos GPCR conocidos. Este par podría haber dado lugar a los genes de los receptores olfativos. Pero no lo hizo. Eso implicaba una de dos cosas: o bien los receptores olfativos no eran GPCR, o bien los receptores olfativos podrían ser una nueva familia de GPCR con secuencias diferentes. Si eran GPCR divergentes, entonces ¿cómo atraparlos?

Buck realizó dos cambios. En primer lugar, utilizó cebadores degenerados, que son secuencias cortas de nucleótidos que se unen de forma complementaria a determinadas secuencias del genoma en las que algunas posiciones de las secuencias del cebador tienen más de una base posible. En segundo lugar, no utilizó ADN sino que trabajó con ARN (convirtiendo el ARN en ADNc). Estos ajustes ampliaron significativamente el alcance de la PCR. Aunque los cebadores degenerados de la PCR se habían utilizado anteriormente para encontrar nuevos miembros de una familia conocida de GPCR con algunas secuencias establecidas, ésta fue la primera vez que se usaron para identificar una nueva familia. El uso de cebadores degenerados para encontrar los receptores olfativos parecía más una apuesta arriesgada que un plan sistemático.

Buck siguió tres pasos: diseño del cebador, amplificación del material genético y pruebas para encontrar una relación familiar. Diseñó 11 cebadores degenerados: «Recogí todas esas secuencias de los [GPCR] conocidos, que era un número muy limitado, y las alineé a mano. Y luego diseñé cebadores degenerados que, al ser utilizados en 30 combinaciones diferentes, tendrían la capacidad de amplificar cualquiera de esos GPCR». Y añadió: «Cuando llegó el momento de los GPCR y los cebadores generales, pensé: hay diferentes GPCR… quizás los receptores olfativos son GPCR. Pero quizá sean otro tipo de receptores, quizá son de tipo nuclear. Así que, en realidad, diseñé los cebadores generales no sólo para los GPCR, sino también para la familia de receptores nucleares».

Buck lanzó una red más amplia. ¿Cómo saber si había tenido éxito? Probó sus cebadores en ADNc amplificado que se transcribió de forma inversa a partir de ARN (es decir, utilizando RT-PCR)

aislado del epitelio olfativo de la rata: un giro ingenioso. En lugar de analizar el ADN genómico, la RT-PCR rastrea la expresión de ARN. Los receptores olfativos deberían estar altamente expresados en el tejido del epitelio olfativo; por lo tanto, este enfoque debería orientar la búsqueda hacia los receptores olfativos en lugar de al resto de la superfamilia de GPCR. Este procedimiento produjo 64 bandas de ADNc con posibles secuencias de GPCR. Se suponía que los receptores olfativos eran heterogéneos, por lo que Buck buscaba una banda con múltiples genes. Para identificar dicha banda, las 64 bandas se cortaron en fragmentos con enzimas de restricción. La cuestión era si estos fragmentos sumaban un peso molecular mayor o igual al de la banda sin cortar. Si una banda contenía sólo un gen, sus fragmentos se sumarían a un peso igual al de la banda original. Sin embargo, si una banda contenía múltiples genes, sus fragmentos se sumarían a un peso molecular mayor que la banda original. Sólo una banda mostró esta característica.

Finalmente, para asegurarse de que se trataba de GPCR olfativos (y no de otros), utilizó un Northern blot para comparar la expresión del material del epitelio olfativo con la de otros tejidos. Los resultados fueron contundentes y se extendieron como un reguero de pólvora. El descubrimiento del receptor olfativo aportaba conocimientos fundamentales sobre los mecanismos de la olfacción. Su trabajo demostró que la rata tiene una familia multigénica que codifica más de cien receptores odorantes diferentes, todos relacionados, pero cada uno de ellos único. La mayor familia de genes del genoma. El tamaño y la diversidad sin precedentes de esta familia explicaban la capacidad de los mamíferos para detectar una amplia gama de sustancias químicas diversas como si tuvieran olores distintos.

Buck y Axel, en 1991 hicieron algo más que encontrar los receptores responsables del reconocimiento de los olores. Su descubrimiento reveló que estas proteínas proporcionan un modelo molecular excepcionalmente versátil para investigar las relaciones estructura-función en las interacciones ligando-proteína, la regulación de los genes y la orientación de los axones. La identificación de los receptores olfativos como miembros de la superfamilia de GPCR cambió la importancia de la olfacción en la ciencia moderna: los GPCR forman parte de muchos procesos fundamentales de señalización celular; hasta el 50% de los fármacos se dirigen a los GPCR y los receptores olfativos son de especial interés para el estudio de los GPCR porque presentan su clase más amplia y diversa.

No hay que subestimar la persistencia de Buck, sobre todo como investigadora novel en un campo de la biología molecular fuertemente dominado por los hombres en la década de 1980.  Según Firestein:

Aprecio a Linda porque para mí es el retrato del valor en la ciencia. La utilizo como ejemplo con los estudiantes. Ella fue tras un resultado que no tenía medias tintas, ninguna alternativa publicable… Si otra persona en algún otro laboratorio hubiera encontrado los receptores olfativos [Richard] no habría desaparecido en la oscuridad. Pero para Linda, una posdoctoral de edad indeterminada, eso era lo que estaba en juego. Se estaba apostando la casa y tal vez su carrera científica. En el entorno actual, que hace hincapié en la investigación traslacional, en la generación de derechos de patentes y en hacer algo «útil», es difícil encontrar estos ejemplos de valentía científica. Linda nos recuerda que la valentía funciona.

Mucha de la investigación actual se enmarca en una concepción de la ciencia que se basa en una concepción normativa de la mejor práctica como impulsada por la hipótesis. La investigación exploratoria se deja de lado rutinariamente como «preparatoria». Esto ofrece una imagen limitada de la ciencia, advirtió Buck: «No soy partidaria de la investigación basada en hipótesis. Prefiero llamarla investigación por descubrimiento. Porque cuando la gente tiene una hipótesis, su tendencia general es tratar de demostrar lo que se le ha ocurrido. Y creo que eso es como ponerle anteojeras a un caballo. Se cierra. Puede impedir que la gente vea lo que hay que no se espera». Albert Szent-Gyorgyi, premio Nobel por el descubrimiento de la vitamina C, destacó: «El descubrimiento consiste en ver lo que todo el mundo ha visto, y pensar lo que nadie ha pensado».

Linda Buck terminaba su discurso del Nobel con estas palabras. «Como mujer en la ciencia, espero sinceramente que el hecho de que yo reciba un Premio Nobel envíe un mensaje a las mujeres jóvenes de todo el mundo de que las puertas están abiertas para ellas y que deben seguir sus sueños».

Para leer más:

• Barwich A-S (2020) What Makes a Discovery Successful? The Story of Linda Buck and the Olfactory Receptors. Cell 181(4):749-753.
• Buck LB (2004) The search for odorant receptors. Cell 116: S117-S119
• Buck L, Axel R (1991) A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell 65: 175-187.
• Firestein S (2001) How the olfactory system makes sense of scents. Nature 413: 211-218.
• https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2004/buck/lecture/